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年7月马萨诸塞大学学者SharonB.Cantor于MoleculaCell发表文章ReplicationgapsareakeydeterminantofPARPinhibitorsyntheticlethalitywithBRCAdeficiency其研究强调了将ssDNA缺口视为PARPi合成致死率的关键生物标志物和决定因素的重要性。
BRCA1中的突变或BRCA2(BRCA)中的聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂（PARPi）合成致死。致死性被认为源自DNA双链断裂(DSB)，在同源重组(HR)和/或叉保护(FP)中需要BRCA功能。PARPi在BRCA或通过同源重组(HR)修复DSB所需的其他基因缺陷的癌症中具有显着的抗癌活性。BRCA蛋白还在叉保护(FP)中起作用，这限制了停滞的复制叉的过度核酸降解。在它们缺席的情况下，停滞的前叉预计会崩溃成DSB。相应地，PARPiolaparib被认为将PARP1捕获在DNA上并干扰DNA复制并促进叉塌陷。因此，PARPi被认为在BRCA缺陷细胞中特别具有*性，因为叉会塌陷成由于HR缺陷而无法修复的DSB。在BRCA缺陷型癌症中，HR和/或FP的恢复与化学抗性相关的观察结果与这种DSB治疗反应模型一致。
最近，停滞的叉模型面临着观察结果，即PARPiolaparib不会减慢或阻止DNA复制，而是加速了DNA复制。这种无限制的复制与PARP1在促进复制叉逆转中的作用一致，这是一种复制叉在遇到复制障碍时变慢、暂停和反向的机制。为了适应PARPi*性的DSB框架，有人提出不受限制的复制导致DSB形成。因此，虽然PARPi引起DSB的拟议机制已经发展，但DSB驱动BRCA缺陷癌症的合成致死率的基本概念在很大程度上仍未受到挑战。
图1：PARPi诱导的叉延长和ssDNA缺口在BRCA1缺陷细胞中更大，但在FANCJ缺陷细胞中则不然
虽然目前的模型强调DSB是PARPi的致敏病变，但单链DNA(ssDNA)断裂或缺口通常与诱导复制应激的药物有关，并且在历史上被认为是基因*性化疗反应。同样，PARPi会导致单链断裂(SSB)、缺口和缺口的积累。缺口的来源可能包括多种PARP1功能的丧失，例如ssDNA断裂修复或冈崎片段加工(OFP)。
在功能上，PARP1通过其合成ADP-核糖或PAR的蛋白质偶联聚合物的能力将蛋白质募集到ssDNA。逃避规范FEN1和LIG1处理的未完全处理的冈崎片段与PARP1结合，并激活PAR信号传导。PARP1然后招募X射线修复交叉互补蛋白1，XRCC1，以完成OFP。因此，预计PARPi会破坏OFP并产生滞后的链间隙。在传统模型中，缺口/缺口或PARPi捕获的蛋白质被提议在DNA复制过程中转化为DSB，并使缺乏DSB修复的BRCA缺陷细胞敏感。
图2：PARPi引起的前叉加速度和灵敏度可以解耦
多种证据表明PARPi*性可能源于与DSB的最终诱导不同的来源。例如，PARPi使OFP因子缺陷或突变的细胞敏感，例如瓣状核酸内切酶I(FEN1)、LIG1、XRCC1或增殖细胞核抗原(PCNA)。这意味着组合复制间隙是不可逾越的并导致细胞死亡。有趣的是，进一步提高滞后链间隙作为*性的一个原因，FEN1丢失在BRCA-范可尼贫血(FA)缺陷细胞中是合成致死的。此外，PARPi是合成致死的，丢失的基因在HR或FP中没有相应的缺陷。并且在临床中PARPi反应不需要HR缺陷，表明与DSB不同的病变可能会导致细胞死亡。值得注意的是，除了HR和FP，BRCA蛋白还可以防止复制相关的间隙。特别是，中心重组蛋白RAD51在复制间隙抑制(RGS)中发挥作用，其在HR或复制后间隙填充中的作用不同。复制缺口可能是BRCA缺陷细胞复制不足的基础，它为合成致死相互作用提供了机会，在复制过程中或解决过程中功能基因丢失。我们还注意到DSB框架需要让步，因为HR和FP在几个细胞模型中与PARPi反应的关系不同。在这里，我们认为立即诱导广泛的复制间隙可以驱动合成致死率。与这种解释一致，我们报告说BRCA-RAD51缺陷细胞在响应PARPi时积累了过多的间隙。我们的研究结果表明，由于耗尽复制蛋白A(RPA)池的OFP缺陷，间隙导致PARPi诱导的敏感性。相应地，BRCA1缺陷细胞容易受到暴露间隙的RPA对OFP和ssDNA结合的抑制。BRCA1缺陷细胞中的OFP缺陷因53BP1的缺失而被挽救，表明滞后链间隙是PARPi合成致死率的关键决定因素，应被视为PARPi反应的生物标志物。
图3：间隙抑制与PARPi抗性相关，再敏化可恢复间隙
由于缺乏PARPi耐药性的临床干预措施，因此了解致敏病变至关重要。考虑到HR和FP有缺陷的PARPi和BRCA缺陷细胞之间的合成致死性，DSB框架是合乎逻辑的，修复和限制DSB的功能。然而，这种DSB模型并不完全符合细胞模型和临床结果。此外，复制相关ssDNA缺口的抑制和修复也是BRCA和PARP1通路的一个功能。因此，我们考虑了由PARP1和BRCA的联合缺失引起的ssDNA缺口是否会导致合成致死率。与间隙模型一致，我们观察到RGS是获得性PARPi抗性的基础，再敏化可以恢复间隙。我们还揭示了BRCA1缺陷细胞中的复制间隙是由OFP缺陷引起的，并且53BP1缺失通过参与由PARP1-XRCC1-LIG3介导的备用滞后链连接途径来逆转这种缺陷。因此，DKO细胞获得XRCC1和LIG3以及对PARP1、FEN1、泛连接酶或甲基化剂MMS抑制剂的抗性。值得注意的是，DKO细胞中的LIG3耗竭恢复了PAR和PARPi敏感性，这一结果与广泛的间隙诱导有关，但与DSB无关。临床相关性也得到支持，因为与BRCA熟练的对照相比，BRCA缺陷的永生化细胞、癌细胞系和患者肿瘤中的差距积累得更多。值得注意的是，BRCA1缺陷细胞也表现出对RPA抑制剂的敏感性，RPA抑制剂可增加PARPi的合成致死率。因此，我们提出PARPi会杀死BRCA1缺陷细胞，因为复合滞后链间隙耗尽了RPA池，并且间隙积累是治疗敏感性和“BRCAness”的根本原因。
图4：无论HR和叉保护(FP)熟练程度如何，PARPi都会诱导间隙并使细胞敏感
我们的数据还强调，PARPi的敏感性并非源于速度阈值，而是超过RPA池的差距阈值。据报道，我们发现PARPi延长了复制区，在BRCA缺陷细胞中明显更长。然而，复制区是不连续的。相比之下，超长束在p21耗尽的细胞中是连续的，这些细胞对PARPi不敏感，暗示间隙是*性因素。无间隙的延长可以通过跨损伤合成(TLS)介导。p21是一种TLS抑制剂，BRCA2缺陷细胞中增强的TLS赋予抗性。此外，TLS抑制了化疗或致癌基因引起的间隙并抵消酵母中的缺口。当TLS没有避免并被药物暴露时，间隙和RPA耗尽可能会导致复制压力的结果。相应地，通过RPA消耗或抑制调节间隙阈值增强了BRCA1缺陷细胞对PARPi的敏感性，而RPA过表达限制了这种敏感性。同样，RPA损失可能会暴露转换为DSB的差距；然而，我们的研究结果表明，大量PARPi诱导的DSB源于细胞凋亡，而不是直接来自PARPi，这增加了DSB不是主要杀伤事件的可能性。目前尚不清楚不受细胞凋亡抑制的DSB是否直接源于PARPi并且是细胞致死的，还是由细胞凋亡的部分抑制或其他技术问题引起的。完整的动力学分析对于破译这些事件之间的关系也至关重要，但表明基因*素诱导的DSB在很大程度上源自细胞凋亡。
我们的间隙模型与最近的报告一致，该报告揭示了BRCA缺陷细胞中形成的间隙与DSB无关。虽然最终PARPi诱导的叉降解、塌陷和/或DSBs可能导致BRCA缺陷细胞的*性，但我们提出了一系列功能分离模型，表明在立即诱导间隙之间有更大的预测和PARPi的*性大于HR或FP的损失。一个重要的比较揭示了BRCA1和FANCJ之间的差距作为区分因素。两者都在遗传性乳腺癌/卵巢癌和FA中发生突变，它们的丢失破坏了HR和FP。但与BRCA1丢失不同，FANCJ丢失不会对PARPi敏感或在未受攻击的细胞中产生间隙或PAR。处理PARPi诱导的DSB不需要FANCJ，或者DSB不是致敏病变。从逻辑上讲，如果DSB是致敏病变，那么HR熟练细胞应该修复DSB并显示PARPi抗性。然而，HR熟练的FA细胞系RAD51-TP是敏感的，尽管不过敏，可能是因为其生长缓慢或擅长HR和/或复制后间隙修复，这与RGS不同。然而，即使通过RADX消耗恢复FP，灵敏度也不会改变，这表明HR和FP不足以赋予PARPi抗性。
图5：BRCA1缺陷细胞中的PARPi合成致死率与RPA耗竭有关，并且可以通过靶向RPA来增强
与DSB修复无关的合成致死组合的范围进一步支持了合成致死来自不同病变的概念。此外，PARPi和XRCC1、FEN1和BRCA缺陷，或PCNAOFP突变体和BRCA1缺陷之间的合成致死性也暗示由于OFP缺陷导致的间隙是致敏病变。即使在赋予PARPi反应的HR缺陷的经典范式中，合成致死率也包括广泛的间隙诱导。这至少表明差距是反应的生物标志物。有趣的是，BRCA-RAD51通路不仅在RGS中起作用，而且在复制后间隙填充中起作用。因此，不同的BRCA功能可以促进PARP1的去除、处理未连接的OF，或填补复制后的空白。
OFP缺陷的间隙可能导致无限制复制的出现。类似于FEN1、LIG1、PCNA或PARP1等OFP的缺失，BRCA-RAD51通路蛋白的缺失与无限制复制相关。从机制上讲，滞后链间隙可能会干扰新生链退火反应，从而减缓和重塑复制叉。相应地，在FANCJ缺陷细胞中，不存在滞后链间隙，这可能是由于亲本DNA形成G4，并且复制受到高度限制。
图6：PARPi敏感细胞在PARPi电阻时显示出高PAR反转
我们的研究还对53BP1缺失如何从PARPi敏感性和胚胎致死率中拯救BRCA1缺陷具有重要意义。53BP1在不受干扰和受干扰的复制中起作用。复制和BRCA1表达的双重缺陷可以增强染色质中的53BP1，因为复制稀释了其募集组蛋白标记，进而有利于BRCA1结合。在BRCA1KO细胞中，53BP1可能会干扰XRCC1募集或其处理滞后链的尝试。值得注意的是，53BP1的缺失导致间隙形成，为PARP1-XRCC1绑定提供平台。或者，假设53BP1存在于与DNA聚合酶α(Polα)的复合物中，53BP1缺失可以通过释放隔离的Polα池来部分挽救BRCA1KO细胞中的复制。如果这种情况是正确的，那么Polα抑制剂将使PARPi抗性BRCA1/53BP1缺陷细胞重新敏感。可以想象，BRCA-RAD51缺陷细胞中的滞后链间隙会导致对细胞*性核苷酸的脆弱性。触发姐妹染色单体交换反应，和/或诱发染色单体型畸变。
总之，我们的研究结果建立了一个模型，以帮助进一步开发PARPi的靶向治疗，从而使联合疗法最大化暴露的滞后链间隙。考虑间隙是否是使PARPi抗性细胞重新敏感的遗传脆弱性至关重要。或者它们是否是与PARPi协同作用的组合的基础。将PARPi限制于HR缺陷癌症的理由存在疑问，因为无论BRCA状态如何，卵巢癌患者都有显着的临床益处。此外，未来的一个关键问题将是，在一系列合成致死模型中，间隙是否赋予*性，RGS是否赋予化学抗性，以及靶向RGS通路是否将最大限度地提高基因*性化疗的疗效。这些发现强调了将ssDNA缺口视为PARPi合成致死率的关键生物标志物和决定因素的重要性。
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